2016 年底，国家卫生和计划生育委员会发布了最新版《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》(GB5009.6－2016) ［1］ ，该标准整合并替代了 GB/T 5009.6－2003 ［2］ 、GB/T 9695.1－2008 ［3］ 、GB 5413.3－2010 ［4］ 、GB/T 9695.7 － 2008 ［5］ 、GB/T 14772 － 2008 ［6］ 、GB/T5512－2008 ［7］ 、GB/T 15674－2009 ［8］ 、GB/T 22427.3－2008 ［9］ 、GB/T 10359－2008 ［10］ 等 9 个食品及相关产品中脂肪检测的国家标准。该标准适用于水果、蔬菜及其制品、粮食及粮食制品、肉及肉制品、蛋及蛋制品、乳及乳制品和婴幼儿配方食品等产品中脂肪的测定。
该标准为食品中脂肪含量测定通用国家标准，为食品生产企业内部质控、检验检测机构和监管机构依法检测判定提供了标准依据。但是食品种类纷繁复杂，脂肪存在形式多样，脂肪检测常用的四种方法其原理依据也各不相同，所以通用性检测标准可能存在选择性差的缺点
［11－15］ 。GB 5009.6－2016 标准仅说明了其与 GB/T 5009.3－2003 标准的差异，而没有比较其与被其替代的其他标准的不同之处，其中不乏部分重要的解释说明或限定的测试条件。所以本文就 GB 5009.6－2016 标准的检测原理、适用范围、与被其替代标准的差异等方面进行解读和分析，并对标准文本中未提到、或解释不全的技术要素进行了分析探讨，让检测人员知其然亦知其所以然，以提高检测效率。
1 检测原理
GB 5009.6－2016 标准所列的索氏提取法、酸水解法和碱水解法的基本过程，都是用有机溶剂提取脂肪，然后通过蒸发去除有机溶剂，干燥后最后测得脂肪含量。索氏提取法［16－17］ 中一般以乙醚作为提取剂，提取的物质除中性脂肪外，还有游离脂肪酸、蜡、磷脂、固醇及色素等脂溶性物质，故提出物只能称为粗脂肪。索氏提取是有机物提取常用且提取率较高的方法，但是由于乙醚不能充分渗入样品颗粒内部，或由于脂类与蛋白质或碳水化合物形成结合脂，特别是对于容易吸潮、结块、难以烘干的食品，用索式抽提法并不能将其中的脂类完全提取出来。酸水解法［18－19］ 可与索氏提取法结合，以提取产品中不同存在方式的脂肪［20－21］ 。酸水解法(包括巴布科克法)和碱水解法(又称罗紫－哥特里(Ｒose－Gottlieb)法)的原理相似:用酸或碱分解非脂肪组分，再用有机溶剂萃取，得游离态脂肪和结合态脂肪之和即总脂肪含量。但是酸水解法不适用于高糖或高磷脂样品的处理，因为在热强酸条件下，糖类易碳化，磷脂易分解为脂肪酸和碱［22］ 。
表 1 脂肪检测方法基本情况比较分析Table 1 Comparison and analysis of the basic situation of fat detection methods方法名称 测定参数 适用范围 不适用情况 过程及结果评价索氏提取法 游离态脂肪一般食品:脂肪含量较高，含结合态脂肪较少，能烘干磨细，不易吸潮结块的样品。结合态脂肪 耗时长易偏低酸水解法
游离态及结合态 脂 肪 或 总脂肪某些食品，其所含脂肪包含于组织内部，如淀粉及其焙烤制品(面条、面包之类)，由于乙醚不能充分渗入样品颗粒内部，或由于脂类与蛋白质或碳水化合物形成结合脂，特别是容易吸潮、结块、难以烘干的食品。
高磷脂或高糖食 品，如 鱼 贝蛋等固体样品前处理及索氏提取繁琐，易碳化或分解而偏低碱水解法游离态及结合态 脂 肪 或 总脂肪巴氏杀菌乳、灭菌乳、生乳、发酵乳、调制乳、乳粉、炼乳、奶油、稀奶油、干酪和婴幼儿配方食。除上述乳制品外，还适用于豆乳或加水显乳状的食品。非乳状食品国际通用乳及乳制品检测方法 ［17］
盖勃法
游离态及结合态 脂 肪 或 总脂肪巴氏杀菌乳、灭菌乳、生乳。高糖或高磷脂食品及非乳状食品精确度低，易碳化或分解而偏低GB 5009.6－2016 标准在酸水解法中对肉制品和淀粉的前处理做了特殊规定，所以酸水解法理应适用于肉制品、淀粉的总脂肪或脂肪含量测定，但是标准并未对含淀粉食品是否也可以用酸水解法来检测进行说明，而王毅等［19］ 的研究表明，含淀粉且高糖类的食品，如中式糕点，则不适合用酸水解法检测。非乳制品脂肪测定应当以索氏提取法为基础，了解食品中脂肪存在的主要形式，除高磷脂或高糖的情况，其余均可以考虑同时用酸水解法。乳及乳制品则以碱水解法为仲裁方法，盖勃法为补充。李鹏等［23－24］ 的研究表明，在 GB 5009.6－2016 标准中未被采用的氯仿－甲醇法，适用于含结合态酯类比较高，特别是磷脂含量高的样品，如鲜鱼、贝类、肉、禽、蛋等，对于含水量高的样品则更为有效。
2 标准方法适用情况
被 GB 5009.6－2016 标准替代的 9 个标准中，明确规定测定参数为粗脂肪的有 4 个标准、游离脂肪的有 1 个标准、总脂肪的有 3 个标准。所以在应用GB 5009.6－2016 标准时，需要对测定参数和检测范围进行再确认。GB 5009.6－2016 标准中脂肪检测方法基本情况见表 1。
3 检测方法差异及分析
3.1 试样前处理
3.1.1 干燥助剂或碾磨助剂 GB 5009.6－2016 标准对于固体样品前处理过程，没有提出需要添加干燥助剂或碾磨助剂，而多个被替代标准中均提出，样品前处理时需加入干燥助剂或碾磨助剂［16］ (海沙、石英砂、无水硫酸钠、硅藻土等)，因为干燥助剂(组织疏松剂)可以用于水分含量较大、粘稠度高的样品，提高干燥程序，有利于前处理过程。对于某些难于磨碎的样品，如粮食、油料饼粕等，加入适量的碾磨助剂，可以协助碾磨，也可以降低温度，以免脂肪在温度过高时氧化。另外，加入的助剂还需具有一定的吸附能力，当油脂由于碾磨过度溶出较多时，不至于被容器吸附或挥发，而是被吸附在助剂中，因此，被替代标准［2，6－8，10］ 中均要求将助剂及擦拭器皿的擦拭纸转移至萃取装置中，防止脂肪过度溶出损失。
3.1.2 萃取前干燥处理 索氏提取法使用有机溶剂抽提，适用于干燥而分散的样品。当使用乙醚作为提取剂时，乙醚中 1.5% ～2% 水分能够使样品中的非脂类水溶性物质随着脂肪一同被提取出来，从而增加测试结果的正误差［25］ 。在旧版的 5 个标准中均在抽提前对样品进行了去水操作，例如肉类［3］ 和食用菌［8］ 需在(103 ±2) ℃温度下干燥30～60 min;中式糕点和西式糕点需分别在(103 ±2) ℃和(90 ±2) ℃温度下干燥 2 h ［6］ ; 粮食 ［7］ 需在 105 ℃ 温度下干燥30 min;油饼［10］ 需在 80 ℃温度下水浴加热 30 min 或加无水硫酸钠等。GB 5009.6－2016 标准规定直接使用无水乙醚，要求对液体或半固体试样进行干燥处理，对固体样品没有要求，简化了固体试样的前处理步骤。
3.1.3 制样细度要求 需要测定脂肪含量的食品种类纷繁复杂，脂肪存在方式各异，GB 5009.6－2016 标准为对样品细度未做特殊规定，而被替代标准及相关文献有所规定，一般情况下，肉及肉制品需要在绞肉机内至少搅碎两次［2－3］ ，部分标准规定需要过 40 目筛子［2］ ，对于粮油产品和食用菌样品，需要过 1、0.9 mm 圆孔筛子［7－8］ ，对于油料饼粕等脂肪含量高、难以干燥和碾碎的样品则做了更加细致的规定［10］ 。如果不对样品细度进行规定，很难保证脂肪抽提的完全性，必然会造成结果的误差。
3.2 提取剂的选择
GB 5009.6－2016 标准中索氏提取法和酸水解法使用的抽提剂为无水乙醚或石油醚，碱水解法使用无水乙醚和石油醚进行萃取。标准［7］ 和文献 ［16］ 中均有说明:不能用石油醚代替乙醚，因为它不能溶解全部的植物油脂类物质。因此，实验中抽提剂选择无水乙醚优于石油醚［27］ 。文献中也有使用正己烷、三氯甲烷－甲醇、二硫化碳等作为提取剂的情况［28－29］ ，但此类试剂毒性较大，未被标准采用。
3.3 干燥温度
脂肪种类繁多，其中芳香性油脂、挥发性油脂和热不稳定油脂在脂肪测定中，需要控制干燥至恒重的温度和时间［29］ ，GB 5009.6－2016 标准规定恒温条件为95～105 ℃，1 h。相比而言，最高温度略高、恒重时间略短于其他标准。温度过低不能达到干燥恒重的效果，温度过高芳香性油脂、挥发性油脂和热不稳定油脂等容易挥发损失造成负误差，如椰子油、棕榈仁油等，干燥温度不宜高于 80 ℃，温度过高，其中的热不稳定油脂或分解或氧化造成数据失真［29］ ，所以具有挥发性油脂的测定不在 GB 5009.6－2016 标准测定范围内。因此，建议在分析可能含有芳香性油脂、挥发性油脂和热不稳定油脂的样品时，不采用此法。其脂肪的测定，一方面要控制恒重条件，降低温度，或减少干燥时间，避免芳香性油脂的挥发和损失，可以采用真空干燥箱或惰性气体保护来干燥;另一方面注意实验观察，如果有色泽、气味上的变化，就应该修改实验方案。
3.4 验证提取
食品中脂肪检测的关键控制点在脂肪抽提或者溶出效率，即是否完全将食品中的脂肪转移到了有机溶剂中［28－29］ 。各标准中索氏提取耗时较长，对于不同的样品的提取温度、回流速率及抽提时间也有差异，不同样品脂肪抽提所采用的标准及建议条件如表 2 所示。
以乙醚为萃取溶剂时，加热温度一般为 65～75 ℃。具体温度，视抽提管中乙醚回流速度而定，一般以 3～5 min 虹吸一次为标准。水浴温度过高，乙醚流失，导致结果偏低［26］ 。所以验证提取是否完全成为实验质控的重要环节。观察实验如出现以下三种情况中的一种可以认为提取完全:a.二次抽提，二次抽提产物恒重增量不超过0.1% ［3，5］ ;b.观察抽提液乙醚滴在毛玻璃片上无油迹残留［6，8］ ;c.抽提至抽提管内的乙醚用玻璃片检查无油迹［7］ 。
GB 5009.6－2016 标准采用 b 法，具有较好的操作性和准确性。
3.5 空白试验
空白实验一方面可以用于试剂验收，对于存在非挥发性物质的试剂，GB 5413.3－2010 乳与乳制品脂肪检测中需要进行空白实验，以 10 mL 水代替样品进行测试，得出试剂空白，该值通常小于0.5 mg，在常规测定中，可忽略不计。如果全部试剂空白残余物大于0.5 mg，则分别蒸馏100 mL 乙醚和石油醚，测定溶剂残余物的含量，用空的控制瓶测得的残余量和每种溶剂的残余物的含量都不应超过 0.5 mg，否则应更换成合格的试剂或对试剂进行提纯。另一方面空白实验还用于验证抽提效果和环境条件的校准，在 GB 5413.3－2010 中利用无水奶油(1 g)与样品同时测定，以进行空白试验，对测量操作和仪器设备进行同步验证。
在 GB 5009.6－2016 标准中仅对乳及乳制品、婴幼儿配方食品中脂肪测定的碱水解法做了空白实验要求，其余样品及方法未做空白实验做解释，可以认为一般情况下脂肪测定不需要做空白实验，但是在试剂验收和初次试验验证时，还是应进行空白实验［28－29］ 。
3.6 试剂验收与回收由于乙醚中含有水分、乙醇等均会干扰脂肪的提取，使得提取物中含有糖类等非脂类成分［4］ ，会引起正误差。所以 GB 5009.6－2016 标准中规定使用的提取剂为无水乙醚。另一方面乙醚中如含有过氧化物，索氏提取操作容易发生爆炸［4，7，26］ 。实验室在采购乙醚后，可试试剂品质参照文献［26］进行除氧化物、除水、除醇、操作。
为提高实验室环境友好度、降低检测成本，对脂肪测定中使用过的乙醚可以重复利用，重复利用前［4，7，26］ 可参照文献方法先做过氧化物检验及处理［4，26］ ，再进行脱水处理 ［26］ 。
4 结论与展望
GB 5009.6－2016 标准整合并替代了之前的 9 个国家标准，是测定食品中脂肪含量的国家食品安全强制性标准，为生产企业开展内部质控、检验检测机构和监管机构依法检测判定等提供了标准依据。但是，该标准也存在一些通用型标准普遍存在的问题，比如标准适用范围规定不具体，前处理过程描述偏于简略等问题。而同时又因为食品种类纷繁复杂，脂肪存在形式多样等特殊情况，所以，检测人员在实际检测过程中，必须在深刻理解检测方法基本原理基础上，根据样品的具体特性，细化操作步骤和要求，并通过实验验证形成作业指导书，以便更加规范操作过程，保证检测结果的准确性。