田间种植桑树是鉴定桑品种真实性和检测桑种子纯度最为可靠 、准确的方法, 但其检验周期长 ,且易受环境及病虫害等因素的影响。 DNA分子标记检验虽分辨率高 ,但存在费用高、操作繁琐等缺点 。采用电泳分离的蛋白图谱检测农作物种子纯度已有报道[ 1 -3]。利用种子蛋白质电泳图谱鉴定种子纯度具有不需将种子萌发 、送检样品可及时进行分析、电泳后的染色步骤相对简单等优点, 因而利用电泳图谱鉴定桑种子纯度的方法值得探讨。应用该方法检测杂交桑种子纯度时, 首先需建立杂交桑种子自身的标准蛋白质图谱作为对照。为了建立准确 、清晰的标准蛋白质图谱 , 本试验对蛋白质凝胶电泳(SDS-PAGE)中桑种子蛋白质提取液的种类进行了筛选, 并应用梯度法研究了提取液的用量及点样量 。
1　 材料与方法
1.1　 桑品种及桑种子蛋白质提取的处理方法
供试桑品种为沙 2×伦 109、粤桑 11号。将供试桑品种的种子冷藏 30 min后研磨, 将研磨粉碎的单粒种子置于离心管中 ,加入蛋白质提取液,室温下提取 1 h后,置于旋涡混合器上混匀约 1m in,然后放入冷冻离心机中10 000 r /min离心 10min。取其上清液用于电泳 。
1.2　SDS-PAGE电泳方法
参照文献 [ 4]的方法 , SDS-PAGE凝胶配制采用不连续垂直电泳用的配方, 其分离胶和浓缩胶的质量分数分别为 12.5%、5%, 电压 100 V, 电泳约 3h,采用考马斯亮蓝染色 , 扫描获得电泳图谱。主要试剂丙稀酰胺、甲叉双丙稀酰胺 、SDS、AP、TEMED、Tris、考马斯亮蓝 G-250等由生物公司进口分装 , 其余的试剂甘油 、甲醇、冰乙酸 、尿素、乙二醇等从化玻店购买 。

1.3　 蛋白质提取液的筛选
参照文献[ 5]的方法, 将 PO 4 、EX 3 、ddH 2 O以及20%、30%的 2-氯乙醇 5种提取液各设 5个处理,每个处理 点 2 个 样 品。 PO 4 提取 液 :将 0.038 8 gK 2 HPO 4 、0.010 56 g KH 2 PO 4 、5.0 mL 甘油 、0.2 gDTT、0.076 g EDTA溶于 200 mL双蒸水中 。 EX 3 提取液:将 32.43 g尿素 、120 μL乙二醇溶于 1 000mL双蒸水中。以上药品除 2- 氯乙醇为化学纯外 , 其余均为分析纯 。
1.4　 蛋白质提取液的定量分析
用经过筛选的提取液处理单粒桑种子, 然后各取 40 μL上清液进行种子的蛋白含量测定 , 设 3个重复。 用紫外分光光度 法测定, 以牛血清蛋白(BSA)作为标准蛋白, 具体方法如下。首先用紫外分光光度计在 595 nm 波长下测定质量分数为10%、20%、30%、40%、50%、60%的牛血清溶液 ,用于测定沙 2 ×伦 109种子蛋白质含量的吸收值分别为 0.033、0.060、0.089、0.136、0.169、0.203,用于测定粤桑 11号种子的牛血清溶液的吸收值分别为0.010、0.046、0.062、0.083、0.147、0.162。然后 ,根据 6个吸收值建立沙 2 ×伦 109种子的方程 y =0.003 5x - 0.007 4, R2=0.994 3;粤桑 11号种子的方程 y =0.003 1x - 0.023 4, R2=0.961 9。最后在595 nm 波长下测定各上清液的吸收值 ,根据方程可算出各样品提取液提取的种子蛋白质含量 。
1.5　 提取液用量的筛选
从选择的提取液中分别以 60、70、80、90、100、110、120、130、140 μL的用量来提取单粒种子蛋白 ,点样量为 25 μL上清液, 进行不同用量的梯度电泳 。
1.6　 点样量的筛选
以最佳提取液用量处理单粒种子后, 分别选用18、20、23、25、28、30 μL的上清液点样量进行电泳。
2　 结果
2. 1　 蛋白质提取液种类的筛选
用 100 μL提取用量处理单粒种子后, 取 25 μL的上清点样 ,从电泳图谱 (图 1、2)可见试验种子在以 20%、30%的 2-氯乙醇作提取液时得到的蛋白质条带不明显, 以 PO4 、EX3 、ddH2O 作提取液则都可看到蛋白质条带 ,且条带数基本一致 ,而 EX 3 的染色相对清晰,条带分离较好。

2.2　 蛋白质提取液的定量分析
表 1 所示的 试验 数据反 映出 经过 筛选 的ddH2O、PO4 、EX3 等 3种提取液提取的桑种子的蛋白质含量都较低, 但用 EX 3 提取液提取的种子蛋白质含量相对较高,与上述电泳带的清晰度相符,且种子纯度的测定可在单粒种子的前提下进行, 因而在SDS-PAGE电泳中选择 EX 3 作为桑种子首选蛋白质提取液。
2.3　 提取液用量的筛选
如图 3所示, 60 μL用量的桑种子蛋白质条带较清晰,但条带的清晰度有随着提取液用量的增加而变弱的趋势 。因此 ,在 SDS-PAGE电泳中选择 60μL EX3 提取液较适宜单粒桑种子蛋白质提取2.4　 点样量的筛选如图 4所示 , 6个点样量都能测出桑种子的蛋白质图谱, 30 μL的点样量的条带分离度相对较好 、且较清晰,故选择点样量为 30 μL。

3　 讨论
本试验结果可知 , 用 EX3 提取液提取的桑种子蛋白质含量较高,电泳条带相对清晰一些,提取液用量 60 μL、点样量 30 μL的效果较好 。桑种子的质量小 ,其脂肪含量较高 (占 33.4%), 而蛋白含量较低(只有 25%)[ 6],故能从种子中提取的蛋白质含量也不高。提取桑种子的蛋白量和提取液用量、点样量均会影响到电泳条带的清晰度 ,在 SDS-PAGE电泳中也表现出提取蛋白量多 、提取液用量少 、点样量多时电泳条带则相对清晰一些。今后的工作期望能在定量的电泳方法下建立生产上常用的杂交桑种子标准蛋白质图谱,最终建立经济、简便、快速 、实用的电泳方法用于桑种子纯度的测定 。